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影響質(zhì)粒構(gòu)建實(shí)驗(yàn)的因素

更新時(shí)間:2024-05-20點(diǎn)擊次數(shù):1349
  質(zhì)粒最早是20世紀(jì)50年代初期在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的,是細(xì)菌、酵母菌、放線菌等生物中獨(dú)立于染色體(或擬核)以外的閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子,具有自主復(fù)制能力,可在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。那么你知道影響質(zhì)粒構(gòu)建實(shí)驗(yàn)的因素有什么嗎?讓我們一起來(lái)看看吧!
 
  一、載體的選擇
 
  在選取克隆載體時(shí)應(yīng)留意以下幾點(diǎn):
 
 ?、倬邆渥灾鲝?fù)制能力,拷貝數(shù)量眾多;
 
 ?、跀y帶易于篩選的選擇標(biāo)記;
 
 ?、酆卸喾N限制酶識(shí)別序列,以供外源基因插入;
 
  二、引物設(shè)計(jì)留意事項(xiàng)
 
  在構(gòu)建質(zhì)粒時(shí),設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)考慮引物長(zhǎng)度、引物的GC含量、引物的Tm值等因素,并避免引物間出現(xiàn)配對(duì)突變或次級(jí)結(jié)構(gòu)等情況。
 
  前向引物:5’端–上游克隆載體末端同源序列 + 基因正向擴(kuò)增引物 --3’端
 
  反向引物:3’端–基因反向擴(kuò)增引物 + 下游克隆載體末端同源序列 --5’端
 
  在運(yùn)用PCR擴(kuò)增目的基因的過(guò)程中,引物設(shè)計(jì)需留意事項(xiàng):
 
 ?、?引物長(zhǎng)度最好在18-30bp左右,常用的長(zhǎng)度是 20-22bp;
 
 ?、谝?Tm 值最好在 60℃ 左右,兩條引物間 Tm 值要保持接近,相差最好不要超過(guò) 5°C;
 
 ?、跥C 的含量標(biāo)準(zhǔn)通常為 40%-60% 或45-55%;
 
  三、酶切位點(diǎn)的選擇
 
  在構(gòu)建質(zhì)粒時(shí),選擇適當(dāng)?shù)那懈蠲负瓦B接酶至關(guān)重要。對(duì)于切割酶的選擇,應(yīng)該考慮到酶切位點(diǎn)的位置以及酶的反應(yīng)條件等因素。而對(duì)于連接酶的選擇,則應(yīng)根據(jù)所使用的質(zhì)粒載體和目標(biāo)基因的大小來(lái)確定。
 
 ?、龠x擇質(zhì)粒上兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間的距離不宜過(guò)小(>10bp),否則會(huì)影響限制性內(nèi)切酶對(duì)切點(diǎn)的識(shí)別,從而不利于空載體的雙重酶切。
 
  ②在克隆表達(dá)目的基因的情況下,選擇酶切位點(diǎn)時(shí)應(yīng)考慮以下因素:
 
  目標(biāo)基因片段內(nèi)不應(yīng)含有所選酶切位點(diǎn)(否則在檢驗(yàn)陽(yáng)性重組子的雙重酶切時(shí)可能會(huì)切斷目標(biāo)基因)。
 
 ?、墼诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)中使用的所有載體(真核、原核、酵母、昆蟲(chóng))盡可能含有所選的酶切位點(diǎn),并且要確保插入載體時(shí)的方向正確(即定向克隆),以免在更換載體進(jìn)行表達(dá)時(shí)需要重新設(shè)計(jì)引物以引入新的酶切位點(diǎn)。
 
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